BMP15-FAT1对猪卵丘细胞凋亡的影响

吴心慧，孙绪磊，姜昊，高妍，戴立胜，张嘉保*

摘要： 猪卵丘细胞位于卵母细胞外周，作为一种特殊的颗粒细胞，参与卵母细胞发育、卵泡发育与闭锁以及胚胎的生存和发育等重要生殖生理过程。为探求BMP15通过调控卵丘细胞增殖与凋亡，进而影响卵母细胞生长及成熟的作用机制，本研究通过体外添加BMP15， 利用RNA干扰技术、实时荧光定量PCR、流式细胞术等方法，分别检测了添加BMP15后，猪卵丘细胞凋亡情况及凋亡相关通路基因的mRNA表达变化。结果表明：猪BMP15由卵母细胞特异性分泌，可抑制猪卵丘细胞凋亡，同时也可促进FAT1基因的表达；沉默FAT1基因后，BCL2/BAX比率下降，进而影响猪卵丘细胞的凋亡。

关键词：卵丘细胞；BMP15；FAT1通路；凋亡；猪

中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号：0258-7033（2016）05-0030-04

卵丘细胞（cumulus cells，CC）是位于卵母细胞外的一层颗粒细胞，具有保护和支撑卵母细胞、为卵母细胞供给营养并调节卵母细胞生长的作用[1]。卵母细胞与颗粒细胞之间关系密切，有研究表明，卵泡的闭锁可能起始于具有主动性、先天性、选择性的卵丘细胞与颗粒细胞凋亡[2]，因此，可以通过明确颗粒细胞的状态及功能，推测卵母细胞的发育潜能[3-4]。同时，明确卵丘细胞功能与卵母细胞发育之间的相互作用，对解析胚胎的生存及发育潜能尤其重要。

细胞凋亡（Apoptosis）是一种可由基因控制的细胞自主性死亡方式，由Kerr[5]提出，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程，又称细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）。而骨形态发生蛋白15（BMP15）可抑制细胞的凋亡，并对卵母细胞生长具有潜在影响[6]。BMP15属于转化生长因子（TGFβ）超家族成员，不仅在多种组织和细胞中发挥着调节生长、发育的作用[7]，又因为其特异性的在卵母细胞中表达而被广泛认为其对动物繁殖具有潜在影响，并在许多哺乳动物的生殖生理过程中发挥着重要的调控作用[8]。目前针对BMP15在牛、羊和小鼠等的研究报道较多[9-10]，而在猪这一物种中的报道较少。研究结果可为探究BMP15在猪卵丘细胞凋亡中的作用及机制、为动物及人类生殖调控技术的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验实验用的猪卵巢全部采集于长春某屠宰场。重组人BMP15（Recombinant Human BMP15）购自R&D公司，DMEM/F-12培养基购自GIBCO公司，siRNA购自上海吉玛有限责任公司，反转录、荧光定量PCR染料购自TIANGEN公司， 脂质体2000 购自Invitrogen公司，流式细胞术所用试剂盒及染料购自BD公司，HEPES购自AMRESCO公司，PVA、透明质酸酶购自Sigma公司。

用盛有含青霉素和链霉素（100 U/mL）的0.9%温生理盐水的保温瓶将采取的卵巢在1~2 h内运送回实验室。选择形态良好、健康状态较好的卵巢，剪掉表面系膜等多余结缔组织后，用生理盐水冲洗3次，放入干净的玻璃烧杯中，于37℃恒温水浴锅内放置。用20 mL注射器抽取直径为3~8 mm卵泡的卵泡液，将抽得的卵泡液缓缓注入含0.1% PVA的HEPES溶液里于50 mL离心管内，静置10~20 min，使细胞沉淀至离心管底部，吸取沉淀于盛有捡卵液（含0.1%PVA的HEPES溶液，防止细胞贴壁） 的9 mm培养皿中，在体视显微镜下，捡出卵丘层数大于等于5、包裹紧密完整的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），在捡卵液中清洗2~3次。将COCs转移到200 μL含透明质酸酶（300 μg/mL）的HEPES溶液中，反复吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全分离。将全部液体滴入60 mm培养皿中，在显微镜下捡出裸卵后，将余下含卵丘细胞的液体收集于1.5 mL离心管中，加入HEPES溶液至1 mL，充分吹散开卵丘细胞，3000 r/min离心洗涤，2~3次，最后用DMEM/F-12细胞培养液离心洗涤，3000 r/min，1~2次。将分离得到的猪卵丘细胞重悬，吸取20 μL混匀的细胞悬液与细胞计数板上，在显微镜下观察、计数。将分离得到的猪卵丘细胞悬液根据细胞计数结果分别放入培养板中各孔，保证细胞密度为1×105 个/mL。细胞培养液为DMEM/F-12（含1%双抗，10%胎牛血清），在37.5℃，5% CO2培养箱中培养。

待细胞培养板中细胞铺满80%时，分别加入含0、100 ng/mL BMP15的细胞培养基，以空白为对照组，在37.5℃，5% CO2培养箱中培养48 h后收细胞。

1.3 猪卵丘细胞凋亡水平检测按照FITC AnnexinV Apoptosis Detection Kit I说明书步骤进行操作。（1）收集细胞：将培养处理结束的细胞用DPBS清洗2次，用胰酶消化细胞，收集1×106个/mL细胞于1.5 mL离心管中。（2）细胞染色：将收集的细胞离心，4℃，200 g，2次；每个离心管中加入100 μL 1×Binding Buffer，将细胞吹悬，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI。轻轻混匀，在室温（25℃）下避光孵育15 min。（3）检测细胞凋亡水平：各处理样品分别加100 μL BindingBuffer稀释，转入测试管内，流式细胞仪检测。

1.4 si-RNA的合成与细胞转染FAT1基因的si-RNA（以下简写为si-FAT1）由上海吉玛有限责任公司设计合成。将F1代猪卵丘细胞按1×105个/mL接种于12孔板中，待细胞融合度达到80%时，进行转染，将脂质体2000、si-RNA恢复至室温，混匀各试剂。用相应剂量无血清无双抗DMEM/F-12细胞培养基将相应剂量脂质体2000和si-RNA稀释，静置5 min。将稀释好的脂质体2000和si-RNA充分混匀，室温放置20 min，以便形成si-RNA/lipofectamin复合物。将细胞培养板中各孔细胞培养基换成无血清无双抗的DMEM/F -12 细胞培养基。将相应剂量si -RNA/lipofectamin复合物加到待培养的细胞培养板中，在37.5℃，5% CO2培养箱中培养，培养24 h后收细胞。

1.5 猪卵丘细胞总RNA提取及反转录猪卵丘细胞总RNA的提取采用Trizol法。得到的RNA样品用Nano Drop 2000进行RNA浓度的检测，用琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量进行检测。利用FastQuant RT Kit（with gDNase）将提取的猪卵丘细胞总RNA进行反转录，得到相应的cDNA，-20℃冰箱保存，用于后续实验。

1.6 mRNA表达水平检测反转录后，利用SuperRealPreMix Plus（SYBR Green）对不同处理的猪卵丘细胞cDNA进行荧光定量PCR的检测。用于RT-QPCR的引物序列和预扩增片段大小如表1所示，反应体系按照表2进行。

1.7 统计分析并利用SPSS 19.0软件进行分析，不同组之间的数据是通过ANOVA进行分析，规定P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。实验数据均由多个重复实验的平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 猪卵丘细胞的体外分离及培养为了保证卵丘细胞的数量和质量，在镜下选择卵丘细胞包裹较为紧密且包裹层数在5层或以上的卵丘-卵母细胞复合体，图1所示为40倍镜下，已贴壁生长的原代猪卵丘细胞，细胞呈梭形，生长状态良好。

2.2 BMP15在猪卵母细胞中特异性表达为了明确BMP15是否在猪卵母细胞中能够特异性表达，我们分别提取体外成功培养的猪卵母细胞和猪卵丘细胞的总RNA，经反转录后，利用PCR技术进行了BMP15表达量的检测。如图2所示，只有猪卵母细胞的cDNA经扩增后获得了条带，而猪卵丘细胞的cDNA并未扩增出条带，说明BMP15是由猪卵母细胞特异性分泌的，而在猪卵丘细胞中不表达BMP15。

2.3 外源添加BMP15可抑制猪卵丘细胞凋亡流式细胞检测的结果表明，与对照组相比，BMP15添加组的猪卵丘细胞凋亡率有显著地下降（P<0.01），说明BMP15具有抑制猪卵丘细胞凋亡的作用，如图3所示。

2.4 BMP15 能促进FAT1 基因的表达荧光定量PCR结果如图4所示，外源添加BMP15可以促进FAT1表达量的上升（P<0.01）。

2.5 抑制FAT1基因表达会增加猪卵丘细胞的凋亡经检测，FAT1基因表达抑制效率达到60%以上，如图5（左）所示。而伴随着FAT1基因表达量的下降，与阴性对照组相比，猪卵丘细胞的凋亡率显著性的上升（P<0.01），如图5（右）所示，表明在猪卵丘细胞中，FAT1也发挥着抑制细胞凋亡的作用。

2.6 BCL2/BAX mRNA表达水平变化在利用流式细胞检测的同时，我们也通过荧光定量PCR法检测凋亡标志基因的表达变化，结果表明，FAT1抑制组与对照组相比，BAX的mRNA表达水平有所上升，而BCL2的表达水平有所下降，而BCL2/BAX mRNA的表达水平比值下降，如图6所示。这从基因水平说明FAT1基因具有抗凋亡的作用。

3 讨论

目前关于BMP15 在卵丘细胞中的表达，研究结果不尽一致。有研究证实BMP15在猪、牛、羊等各个物种中均无表达[11]，也有报道BMP15在牛、羊中有表达[12]；而本实验证明BMP15只在猪卵母细胞中特异性表达，而在卵丘细胞中无表达。项目组前期高通量研究结果表明，BMP15可促进FAT1基因的mRN水平表达，且BMP15与FAT1可通过协同作用，对猪卵丘细胞的生长及凋亡发挥潜在作用。

BCL2基因家族根据其功能的不同可分为抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡蛋白两大类，其中BCL2和BAX分别是BCL家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡的蛋白，且BAX是BCL2活性的主要调控因子[13]。研究发现，通常情况下BCL2和BAX两种蛋白的表达量相对稳定，而当BAX在细胞内过高表达时，BAX/BAX同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡；而当BCL2在细胞内过高表达时，BAX/BAX二聚体则大量解离，生成更为稳定的BCL2/BAX异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用，使细胞存活期延长[6，14]。多项研究也认为细胞内这两种对立蛋白间的比率关系是决定细胞存亡的关键[15]。本研究中，抑制FAT1基因mRNA表达后，BCL2/BAX的比值显著下降，表明FAT1可通过BCL2/BAX通路调控猪卵丘细胞的凋亡。

随后，我们通过流式细胞法证实BMP15可以抑制猪卵丘细胞的凋亡，并同时通过荧光定量PCR的检测发现，BMP15可以促进FAT1基因的表达量上升，这说明BMP15调控了FAT1基因的表达水平。在抑制FAT1基因表达以后，猪卵丘细胞的凋亡率有所上升，说明FAT1也起到了抑制猪卵丘细胞凋亡的作用。而后，对细胞凋亡关键因子BCL2和BAX mRNA检测结果表明，BCL2/BAX的比值在FAT1基因表达受抑制后有所下调。综上所述，在猪卵丘细胞中，BMP15通过FAT1调控BCL2/BAX而影响猪卵丘细胞的凋亡。

4 结论

本研究成功分离了猪卵丘细胞，在体外培养环境中添加了BMP15，结果表明，BMP15可以促进FAT1基因的表达；而FAT1基因也具有抑制猪卵丘细胞凋亡的作用。在此卵丘细胞凋亡的过程中，BCL2/BAX发挥了明显作用。这说明卵丘细胞可通过BMP15-FAT1-BCL2/BAX这一通路进行细胞凋亡的自我调控。由于卵丘细胞的增殖与凋亡不仅影响着卵母细胞的发育及生长，还影响着卵泡的发育和闭锁等生理过程，本研究及后续工作可为明确卵母细胞-卵丘细胞相互调节的机制及动物繁殖生物技术的开发提供理论依据。

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收稿日期：2015-11-11；修回日期：2015-11-29

资助项目：吉林省青年科研基金（20140520176JH）

作者简介： 吴心慧（1990-）， 女， 硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：sheilavanilla@hotmail.com

* 通讯作者： 张嘉保（1963-）， 男， 博士， 博士生导师， 研究方向为动物遗传育种与繁殖，Email：zjb515@163.com